1. Hvis jeg mottar et rør med frosne celler, kan jeg legge det direkte i flytende nitrogen for lagring?
I mange tilfeller kan celler transportert på tørris (-80°C) settes tilbake i flytende nitrogen og deretter tines raskt etterpå.Cellelevedyktigheten kan imidlertid reduseres etter slik behandling.For noen sensitive cellelinjer kan dette gjøre cellegjenoppretting vanskeligere.Dette fenomenet antas å skyldes en endring i strukturen til iskrystallene inne i cellene som følge av temperaturendringen.Det anbefales derfor at celler tines og dyrkes så snart som mulig etter mottak.Reduser lagringstiden ved -80°C.Denne temperaturen brukes kun til transport.
2. Hvilke sikkerhetstiltak bør tas ved fjerning av celler fra flytende nitrogen for gjenvinning?
Cellekryorør i flytende nitrogen som ikke er helt forseglet og har flytende nitrogen som lekker inn i seg, kan forårsake en eksplosjon dersom temperaturen på kryorøret stiger kraftig ved tining.Det anbefales derfor å bruke vernebriller og vernehansker ved fjerning av celler fra flytende nitrogen.For gjenopplivning bør fryserøret ristes kontinuerlig i et 37°C vannbad for å tine fryseløsningen fullstendig innen 1-2 minutter.Tørk deretter av utsiden av røret med en alkoholserviett, ta det deretter inn i det ultra-rene bordet og overfør cellene til et sentrifugerør med 10 ml kulturmedium tilsatt, sentrifuger ved 1000 rpm i 5-10 minutter, kast supernatanten, tilsett passende mengde kulturmedium og inokuler kulturkolben og inkuber i en 5 % CO2-inkubator.
3. Hvorfor bør celler lagres i dampfasen i en flytende nitrogentank i stedet for i flytende fase?
Celler lagret i gassfasen av flytende nitrogen er mer sannsynlig å bli gjenopplivet.Mens i væskefasen av flytende nitrogen, hvis frysetørkingsrørene ikke er ordentlig forseglet eller har lekkasjer, kan direkte kontakt mellom cellene og det flytende nitrogenet kompromittere levedyktigheten til cellene etter tining.
4. Hvordan bytter jeg kulturmediet for suspensjonsceller?
Dyrking av suspensjonsceller kan gjøres ved ganske enkelt å tilsette ferskt medium (hvis plassen tillater det) eller ved å separere cellene fra det gamle mediet ved sentrifugering (100 xg i 5 minutter) og deretter resuspendere de utfelte cellene i friskt medium.For de fleste suspensjonscellelinjer er det imidlertid en bedre metode å legge til medium.Uansett må mediet fornyes før cellene når sin største metningstetthet.Metningstettheten til cellene varierer mellom 3 x 10 5 og 2 x 10 6 avhengig av cellelinjen og kulturforholdene (hvile eller omrøring, oksygeneringsnivåer, etc.).Celler må fortynnes til en lavere cellekonsentrasjon for å tillate tilstrekkelig næringsgjenvinning for å holde cellene i vekst logaritmisk.Hvis mediet ganske enkelt endres uten å redusere celletettheten, vil cellene raskt tømme mediet og dø.Hvis cellene fortynnes under sin minste tetthet, vil de gå inn i en etterslepfase og vokse veldig sakte eller dø.Hver suspensjonscellelinje har en annen metningstetthet og passasjeintervall, så daglige celletall er måten å overvåke suspensjonscellelinjer*.
5. Hva er anbefalt CO2-nivå for cellekultur?
Selv om CO2-nivåer i cellekultursystemer varierer fra 0,03 % til 40 % (typisk rundt 0,03 % CO2 i atmosfæren), er det svært vanlig å ikke ha CO2 tilsatt luften eller en CO2-konsentrasjon på 5 % til 10 %.Det er viktig å justere konsentrasjonen av natriumbikarbonat i mediet for å balansere med CO2-nivået i gassfasen.Celler produserer CO2 og krever en liten mengde karbonsyre for vekst og overlevelse.Hvis det ikke tilsettes CO2 og cellene formerer seg, kan 4 mM (0,34 g/L) vannfritt natriumbikarbonat brukes.Imidlertid bør lokket på kulturkolben strammes på dette tidspunktet.Hvis kultursystemet krever 5 % eller 10 % CO2, bruk henholdsvis 23,5 mM (1,97 g/L) eller 47 mM (3,95 g/L) natriumbikarbonat ved 37°C, med en initial pH på ca. 7,6.Under disse forholdene bør kolben stå uten lokk eller en petriskål brukes for å opprettholde gasslikevekt.
6. Hvorfor trenger noen celler natriumpyruvat?Hvor mye natriumpyruvat bør jeg legge til mediet?
Pyruvat er en organisk syremetabolitt i den glykolytiske veien* som lett kommer inn og forlater cellen.Derfor gir tilsetning av natriumpyruvat til mediet både en energikilde og en karbonkilde for anabolisme, bidrar til å opprettholde visse spesifikke celler, hjelper med cellekloning eller er nødvendig når serumkonsentrasjonene i mediet reduseres.Natriumpyruvat bidrar også til å redusere fluorescensindusert cytotoksisitet.Natriumpyruvat tilsettes vanligvis i en sluttkonsentrasjon på 1 mM.kommersielt tilgjengelige natriumpyruvatløsninger er vanligvis 100 mM lagringsløsning (100X).
Oversatt med www.DeepL.com/Translator (gratisversjon).
Innleggstid: 21. juni 2022