Sanntidsfluorescens kvantitativ PCR er en metode for å måle den totale mengden produkt etter hver polymerasekjedereaksjon (PCR) syklus i en DNA-amplifikasjonsreaksjon ved bruk av en fluorofor.Metoden brukes til å kvantifisere spesifikke DNA-sekvenser i prøven som skal testes ved interne eller eksterne referansemetoder.Siden starten har fluorescerende kvantitative PCR-analyser blitt stadig mer populære blant laboratorielærere.
Fluorescens PCR-prinsipp: Fluorescens PCR, først kalt TaqManPCR og senere også Real-TimePCR, er en ny nukleinsyrekvantifiseringsteknikk utviklet av PE (PerkinElmer) i USA i 1995. Teknikken er basert på tilsetning av en fluorescensmerket probe eller tilsvarende. fluorescerende fargestoff til konvensjonell PCR for å oppnå sin kvantitative funksjon.Prinsippet: ettersom PCR-reaksjonen fortsetter, akkumuleres PCR-reaksjonsproduktene og intensiteten til det fluorescerende signalet øker i like stor grad.Med hver syklus samles et fluorescensintensitetssignal slik at vi kan overvåke endringen i produktmengde ved endringen i fluorescensintensitet og dermed få en fluorescensamplifikasjonskurvegraf.
Generelt kan fluorescensamplifikasjonskurven deles inn i tre faser: fluorescensbakgrunnssignalfasen, fluorescenssignalets eksponentielle amplifikasjonsfase og platåfasen.Under bakgrunnssignalfasen blir det forsterkede fluorescenssignalet maskert av fluorescensbakgrunnssignalet og endringer i produktmengde kan ikke bestemmes.I platåfasen øker ikke amplifikasjonsproduktet lenger eksponentielt, det er ingen lineær sammenheng mellom sluttproduktmengden og startmalmengden, og start-DNA-kopitallet kan ikke beregnes basert på den endelige PCR-produktmengden.Bare i den eksponentielle amplifikasjonsfasen av det fluorescerende signalet er det en lineær sammenheng mellom logaritmen til PCR-produktmengden og startmalmengden, og vi kan velge å kvantifisere dette på dette stadiet.For å gjøre det lettere for kvantifisering og sammenligning, har to svært viktige konsepter blitt introdusert i sanntids fluorescerende kvantitativ PCR-teknikk: fluorescensterskelen og CT-verdien.
Terskelen er en kunstig innstilt verdi på fluorescensamplifikasjonskurven.eksponentiell fase av PCR-amplifikasjon.
Ct-verdi: er antall sykluser som fluorescenssignalet i hvert reaksjonsrør har gjennomgått for å nå den angitte domeneverdien.
Forholdet mellom Ct-verdien og startmalen: studier har vist at Ct-verdien til hver mal har en lineær sammenheng med logaritmen til startkopinummeret til den malen, jo flere kopier av startkopinummeret, jo mindre er Ct verdi.Ct-verdiene er relativt stabile.En standardkurve kan lages ved å bruke en standard med kjent startkopinummer, der den horisontale koordinaten representerer logaritmen til startkopinummeret og den vertikale koordinaten representerer Ct-verdien som vist i figuren under.
Derfor, ved å få Ct-verdien til en ukjent prøve, kan startkopinummeret til den prøven beregnes fra standardkurven.
Ct-verdien er ikke konstant og kan påvirkes av forskjellige prøver og forskjellige instrumenter, selv om samme prøve gjentas 2 ganger på samme instrument, kan Ct-verdien variere.
Kvantitative fluorescensanalyser: Kvantitative fluorescensanalyser kan deles inn i fluorescerende prober og fluorescerende fargestoffer avhengig av markørene som brukes.Fluorescerende prober inkluderer Beacon-teknologi (molekylær beacon-teknologi, representert ved amerikanske Tagyi), TaqMan-prober (representert av ABI) og FRET-teknologi (representert av Roche);fluorescerende fargestoffer inkluderer mettede fluorescerende fargestoffer og ikke-mettede fluorescerende fargestoffer, den typiske representanten for ikke-mettede fluorescerende fargestoffer er SYBRGreen I, som vanligvis brukes nå;mettet Den typiske representanten for ikke-mettede fluorescerende fargestoffer er SYBRGreenⅠ;mettede fluorescerende fargestoffer er EvaGreen, LCGreen, etc.
SYBRGreenI er et vanlig brukt DNA-bindende fargestoff for fluorescerende PCR, som binder seg ikke-spesifikt til dobbelttrådet DNA.I sin frie tilstand avgir SYBRGreenI en svak fluorescens, men når den er bundet til dobbelttrådet DNA, øker fluorescensen 1000 ganger.Derfor er det totale fluorescenssignalet som sendes ut av en reaksjon proporsjonalt med mengden dobbelttrådet DNA som er tilstede og øker når amplifikasjonsproduktet øker.
Fordeler med dobbelttrådet DNA-bindende fargestoffer: enkel eksperimentell design, bare 2 primere kreves, ikke behov for å designe prober, ikke behov for å designe flere prober for rask testing av flere gener, evne til å utføre smeltepunktskurveanalyse, teste spesifisiteten til amplifikasjonsreaksjon, lav startkostnad, god generalitet og derfor mer vanlig i forskning i inn- og utland.
Fluorescerende probemetode (Taqman-teknikk): Når PCR-amplifisering utføres, tilsettes et par primere sammen med en spesifikk fluorescerende probe.Når proben er intakt, absorberes fluorescenssignalet som sendes ut av reportergruppen av den slukkede gruppen og blir ikke detektert av PCR-instrumentet;under PCR-amplifikasjon (i forlengelsesfasen) bryter 5'-3'-spaltningsaktiviteten til Taq-enzymet ned proben enzymatisk, noe som gjør reporterfluorescensgruppen og quenched fluorescensgruppen
Anvendelser av fluorescerende kvantitativ PCR.
Molekylærbiologisk forskning:
1. Kvantitativ nukleinsyreanalyse.Kvantitativ og kvalitativ analyse av smittsomme sykdommer, påvisning av patogene mikroorganismer eller virus, slik som den nylige influensa A (H1N1) epidemien, påvisning av genkopiantall av transgene planter og dyr, påvisning av RNAi-geninaktiveringshastigheter, etc.
2. Differensiell genekspresjonsanalyse.Sammenligning av genekspresjonsforskjeller mellom behandlede prøver (f.eks. medikamentbehandling, fysisk behandling, kjemisk behandling, etc.), ekspresjonsforskjeller av spesifikke gener i ulike faser og bekreftelse av cDNA-mikroarray eller differensielle ekspresjonsresultater
3. SNP-deteksjon.Påvisningen av enkeltnukleotidpolymorfismer er viktig for studiet av individuell mottakelighet for forskjellige sykdommer eller individuell respons på spesifikke legemidler, og på grunn av den geniale strukturen til molekylære beacons, når sekvensinformasjonen til en SNP er kjent, er det enkelt og nøyaktig å bruk denne teknikken for SNP-deteksjon med høy gjennomstrømning.
4. Metyleringsdeteksjon.Metylering er assosiert med mange menneskelige sykdommer, spesielt kreft, og Laird rapporterte om en teknikk kalt Methylight, som behandler DNA før amplifikasjon slik at umetylert cytosin blir uracil og metylert cytosin er upåvirket, ved å bruke spesifikke primere og Taqman-prober for å skille mellom metylert og umetylert DNA .mer følsom.
Medisinsk forskning:
1. Prenatal diagnose: folk kan ikke behandle arvelige sykdommer forårsaket av endret genetisk materiale, og så langt kan de bare redusere antall syke babyer født gjennom prenatal overvåking for å forhindre forekomsten av ulike arvelige sykdommer.Dette er en ikke-invasiv metode som lett aksepteres av gravide kvinner.
2. Patogendeteksjon: Den fluorescerende kvantitative PCR-analysen tillater kvantitativ bestemmelse av patogener som gonococcus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, humant papillomavirus, herpes simplex-virus, humant immunsviktvirus, hepatittvirus, influensavirus, Mycobacterium tubervirus, Mycobacterium tuber.Den har fordelene med høy følsomhet, lav prøvestørrelse, hurtighet og enkelhet sammenlignet med tradisjonelle testmetoder.
3. Legemiddeleffektivitetsvurdering: kvantitativ analyse av hepatitt B-virus (HBV) og hepatitt C-virus (HCV) viser at forholdet mellom virusmengde og effekten av visse legemidler.Hvis serumnivået av HBV-DNA synker under behandling med lamivudin og deretter øker igjen eller overskrider det forrige nivået, er det en indikasjon på virusmutasjon.
4. Onkogenetisk testing: Selv om mekanismen for tumorutvikling ennå ikke er klar, er det allment akseptert at mutasjoner i relevante gener er den underliggende årsaken til onkogen transformasjon.Økt ekspresjon og mutasjon av onkogener kan sees i de tidlige stadiene av mange svulster.Real-time fluorescens kvantitativ PCR er ikke bare effektiv for å oppdage mutasjoner i gener, men kan også nøyaktig oppdage ekspresjonen av onkogener.Denne metoden har blitt brukt til å oppdage ekspresjonen av en rekke gener, inkludert telomerase hTERT-genet, WT1-genet for kronisk granulocytisk leukemi, det onkogene ER-genet, prostatakreft-PSM-genet og tumorassosierte virale gener.
Oversatt med www.DeepL.com/Translator (gratisversjon)
Innleggstid: 21. juni 2022