PCR-teknologi er en nukleinsyreamplifikasjonsteknikk som etterligner prosessen med DNA-replikasjon in vitro.Den gjentar hovedsakelig tre sykluser: høytemperaturdenaturering, lavtemperatur-annealing og forlengelse, og forsterker deretter mål-DNAet millioner av ganger.Dermed har PCR-teknologien fordelen av å være ekstremt sensitiv.Det er imidlertid to sider av hver mynt, og den største ulempen med PCR-teknologi er at den er svært mottakelig for kontaminering, og en svært liten mengde forurensning kan føre til falske positiver.
Når laboratorietukleinsyreforurensning oppstår, må normale eksperimenter stoppes.Betydelige materielle og menneskelige ressurser kreves da inntil kilden til forurensning er funnet, eller rensligheten til laboratoriet er opp til standard.I tillegg skal laboratorierapporten ugyldiggjøres.Resultatene er pålitelige først etter re-eksperimentering.
For å effektivt unngå kontaminering og oppnå stabile og pålitelige testresultater, må vi ofte iverksette visse tiltak for å forhindre eller eliminere forurensning i praksis.
pcr plate
Kilder til forurensning.
Reagensforurensning
Som reagensbeholdere kan kar, vann og andre løsninger bli forurenset med nukleinsyrer under fremstillingen av PCR-reagenser.
Forurensning av utstyr
Halvautomatiske nukleinsyreekstraktorer og helautomatiske nukleinsyreekstraktorer kan føre til at prøver eller nukleinsyremaler søles under ekstraksjon og forurenser maskinen.Eller beholderen inne i utstyret blir ikke rengjort grundig og gjenværende væske eller krystaller fordamper og danner aerosoler, som igjen kan forårsake forurensning.
Krysskontaminering av prøver
Krysskontaminering av prøver kan være forårsaket av en rekke faktorer: kontaminering av prøvetakingsbeholderen;søl av beholderen på grunn av dårlig forsegling når prøven er plassert;prøver som fester seg til utsiden av beholderen;kontaminering av inhalatoren og aerosoler i luften.Spesielt kan virus spre seg gjennom aerosoler eller ved å danne aerosoler, noe som resulterer i gjensidig kontaminering.
PCR-produktforurensning
Dette er det vanligste forurensningsproblemet ved PCR.Det er ofte funnet i analyser som krever åpning etter amplifikasjon eller feil håndtering av produktet etter amplifikasjon.Dette er fordi kopistørrelsen til PCR-produktet er mye større enn maksimum av noen få kopier som er oppdaget av PCR.Derfor kan en svært liten mengde PCR-produktkontaminering resultere i en falsk positiv.
Kloning av plasmidkontaminering
Positive referanser brukes ofte i laboratorieoperasjoner, og de fleste av disse positive referansene kommer fra visse klonede plasmider.Konsentrasjonen av klonede plasmider per volumenhet er svært høy og kan lett bli kontaminert hvis den ikke brukes forsiktig.
Noen laboratorier kloner sine egne plasmider som kvalitetskontrollprodukter.Etter klargjøring håndteres imidlertid ikke avfallet på en streng nok måte, noe som fører til kontaminering av laboratoriet av plasmidene og dermed prøvene.
Tiltak for å kontrollere forurensning
Eksperimentell kompartmentalisering
Rasjonell separasjon av laboratorier.Del opp eller del opp driften av følgende trinn: prøvebehandling, klargjøring av PCR-reaksjonsoppløsning, PCR-syklusamplifisering, PCR-produktidentifikasjon, osv. I tillegg bør spesiell oppmerksomhet rettes mot det faktum at prøvebehandling og PCR-produktidentifikasjon må skilles fra andre trinn.
Det er best å dele dem inn i: prøvebehandlingsområde, forberedelsesområde for PCR-reaksjonsløsning, amplifikasjonsområde for PCR-syklus og område for PCR-produktidentifikasjon.Og deres laboratorieutstyr og aspiratorer bør utelukkende brukes.
UV brukt i laboratoriet bør steriliseres før eksperimentet for å ødelegge gjenværende DNA eller RNA.
Artikler for hver sone bør ikke blandes
Hvert laboratorieområde bør være tydelig merket med forskjellig utstyr og artikler i en iøynefallende farge for å unngå å blande utstyr og artikler fra forskjellige arbeidsområder.For eksempel arbeidsklær, arbeidssko, søppeldunker, mopper, filler, penner osv. brukt utelukkende i hvert område.
Bruk engangspipettespisser, sentrifugerør, støvfrie hansker, masker, etc.
Etabler et standard klimaanlegg og ventilasjonssystem
Bruk komplette leverings- og eksosluftkondisjoneringssystemer luftkondisjoneringssystemer når det er mulig.En streng enkeltstrømretning er nødvendig under tilgang til hvert operasjonsområde, dvs. reagenspreparering og lagringsområde → prøveprepareringsområde → PCR-amplifikasjonsområde → amplifikasjonsproduktanalyseområde, uten retrograd strømning.
Forurensningsovervåking
Kontamineringsovervåking utføres ved å ta følgende tiltak: etablere positive og negative kontroller, gjenta tester, velge primere for ulike regioner for PCR-amplifisering osv., og dermed iverksette tiltak for å forhindre og eliminere kontaminering.
Regelmessig laboratorierengjøring
Forbered desinfiserende løsning som inneholder 0,5 % aktivt klor for å tørke av utstyrsoverflater, benkeplater, gulv, artikkeloverflater, passasjerbokser, dører og vinduer, og bløtlegge søppeldunker inne i utstyret.
Sprøyting av sprit til luft utføres i henhold til ovenfra-ned, innsiden-ut-prinsippet.
Tørk av pipetter, sentrifuger med åtte rør, mikserristere og annet mindre utstyr med alkohol (75%).
Tørk utstyrsoverflater, benkeplater og gulv med renset vann og skyll utstyrsavfallstanker med renset vann.
Oversatt med www.DeepL.com/Translator (gratisversjon)
Innleggstid: 28. september 2022